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　　HCMV与THP-1源性巨噬细胞AIM2炎性体的相互作用及其机制研究.pdf

　　目的1证实HCMV感染THP1源性巨噬细胞后可被AIM2识别，诱导AIM2炎性体活化；2应用SIRNA干扰技术，研究HCMV感染THP1源性巨噬细胞所致炎性体相关分子事件，以明确HCMV诱导的炎性体活化是否依赖AIM2蛋白；3探索HCMV被膜蛋白PUL83与AIM2蛋白之间的相互作用；4明确PUL83AIM2相互作用对AIM2炎性体通路的影响。方法一、HCMV感染THP1源性巨噬细胞诱导AIM2炎性体活化1PMA100NG/ML刺激培养THP1细胞24H获得THP1源性巨噬细胞；2HCMVAD169毒株感染THP1源性巨噬细胞（MOI1后1H、3H、6H、12H、24H、48H和96H收集细胞培养上清，同时设立模拟感染对照组；POLYDADT1G/ML转染THP1源性巨噬细胞24H作为阳性对照组；3取各时间点培养上清，应用ELISA检测细胞因子IL1P和IL18浓度以评估AIM2炎性体活化状态；应用LDH检测试剂盒检测LDH含量以评估细胞死亡情况；4收集感染后1H、6H、24H各组细胞，提取总蛋白，应用免疫共沉淀实验检测HCMV感染后AIM2与ASC蛋白的结合。二、AIM2基因沉默对HCMV诱导的炎性体活化和病毒基因转录的影响1应用AIM2特异性SIRNA转染THP1源性巨噬细胞72H，得到AIM2沉默的巨噬细胞（S，同时用无关SIRNASTEALTHNEGATIVECONTROLLOGC转染THP1源性巨噬细胞，得到模拟沉默对照细胞（SHCMVAD169毒株分别感染S和SMOI1，即S/V和S/V，同时设立模拟感染对照组，即S/V和S/V2感染/模拟感染1H、6H、24H后收集四组细胞总蛋白，采用WESTERNBLOT检测AIM2、PROCASPASE1、P10活化CASPASE1片段）、PROILIP和IL1P的蛋白表达水平；3感染1H、3H、6H、12H和24H后收集V组细胞培养上清，应用ELISA检测细胞因子ILIP和IL18浓度；应用LDH检测试剂盒检测LDH含量；三、HCMV被膜蛋白PUL83与人AIM2蛋白的相互作用1登陆NCBIGENBANK网站，查询HCMVAD169毒株UL83基因序列和人源AIM2基因序列，设计合成扩增全序列的特异性引物以扩增两个目的基因；2应用INFUSION技术将目的基因UL83和AIM2分别插入到PM载体和PVP16载体中，得到PMUL83和PVPAIM2重组表达载体，理论上可分别表达DNABDPUL83和ADAIM2重组蛋白；3应用钙转染法将PMUL83和PVPAIM2转染到HEK293T细胞中，72H后收集细胞提取总蛋白，应用WESTERNBLOT技术检测两个重组表达载体的表达情况；4应用钙转染法将PMUL83、PVPAIM2和分泌型碱性磷酸酶（SEAP报告基因一同转染到HEK293T细胞中，72H后收集细胞培养上清和细胞，应用化学发光法检测上清中SEAP浓度；提取细胞蛋白应用免疫共沉淀法检测两重组蛋白的结合；四、PUL83与AIM2蛋白结合对AIM2炎性体通路的影响1登陆NCBIGENBANK网站，查询人源ASC、CASPASE1和ILIP基因，设计合成全序列特异性引物以扩增目的基因。应用INFUSION技术将ASC、CASPASE1和ILIP基因（保留终止密码子）分别插入到PDSREDN1载体中，理论上，三个重组载体分别表达ASC、PROCASPASE1和PROILIP蛋白；2将PVPAM2和ASC、CASPASEL和ILIP重组表达载体共转染至HEK293T细胞中，命名为RHEK293T细胞，72H后应用WESTERNBLOT检测AIM2、ASC、PROCASPASE1和PROILIP蛋白的表达；3POLYDADT转染RHEK293T6H和24H后提取细胞总蛋白；PMUL83重组表达载体转染RHEK293T细胞后转染POLYDADT6H和24H后提取细胞总蛋白。WESTERNBLOT检测AIM2、ASC、PROCASPASE1、P10、PROILIP和ILIP的蛋白水平；4ASC、CASPASE1和ILIP重组表达载体共转染至HEK293T细胞中，命名为RHEK293TAIM2细胞，重复方法3中的实验。结果一、HCMV感染THP1源性巨噬细胞诱导AIM2炎性体活化1HCMV感染THP1源性巨噬细胞后，IL1P和IL18释放量随着感染时间的推移而增加，前者自感染后12H起明显高于感染前水平，后者在感染48H后明显高于感染前水平，差异有统计学意义；感染组LDH含量在感染后3H，48H和96H时较模拟感染组增高，差异有统计学意义；2在HCMV感染THP1源性巨噬细胞后124H期间，AIM2与ASC蛋白相结合。二、AIM2基因沉默抑制HCMV诱导的炎性体活化和病毒基因转录1AIM2蛋白S细胞感染HCMV后6H，AIM2蛋白含量较感染前明显升高，感染后24H下降；S细胞中几乎无AIM2蛋白表达；2CASPASE1前体与活化片段P10PROCASPASE1在各组细胞中较稳定表达；V组细胞无P10表达；S细胞在感染HCMV后1H可检测到少量P10，624H该片段表达显著增加；S细胞在感染后16H内无P10表达，感染后24H可检测到该片段，但显著低于同时间点S细胞的表达水平，差异有统计学意义；3IL1Β前体与成熟IL1ΒS和S细胞感染HCMV后1H，PROIL1Β表达量均显著增加并持续至感染后6H，但在感染后24H，S细胞显著下降，S细胞稍有下降S细胞的IL1Β于感染后1H开始增加，持续至24H而S细胞的IL1Β在感染后1H和6H相当于感染前水平，感染后24H时该蛋白才表达增加，但显著低于同时间点S细胞的表达水平，差异有统计学意义；三、HCMV被膜蛋白PUL83与细胞AIM2蛋白发生相互作用1PMUL83和PVPAM2重组表达载体构建成功且可在HEK293T细胞中表达；2双杂交实验检测到PMUL83、PVPAIM2和SEAP报告基因在共转染HEK293T细胞后SEAP含量显著增加；3免疫共沉淀实验检测到PMUL83和PVPAM2的表达产物DNABDPUL83和ADAIM2蛋白发生相互作用；4免疫共沉淀检测到HCMV感染THP1源性巨噬细胞后612H，PUL83蛋白同AIM2蛋白发生相互作用。其中，12H时相结合的蛋白较多；免疫荧光共定位检测到二者共定位于胞质中；四、PUL83通过结合AIM2蛋白下调AIM2炎性体通路1成功构建ASC、CASPASE1和IL1Β重组表达载体；WESTERNBLOT检测到RHEK293T细胞可以表达AIM2、ASC、PROCASPASE1和PROIL1Β蛋白；2POLYDADT转染RHEK293T细胞后，PROILIP蛋白表达量较转染前明显增加，CASPASE1活化片段P10以及成熟IL1Β出现；PMUL83重组表达载体转染RHEK293T细胞后再转染POLYDADT时，PUL83蛋白高表达，然而AIM2、PROCASPASE1、PROILIP、P10和成熟IL1Β蛋白水平较转染PMUL83前大幅度减少，ASC蛋白量也有所降低；3POLYDADT在有或无PUL83表达的情况下转染RHEK293TAIM2细胞，ASC、PROCASPASE1和PROILIP蛋白水平无变化，且与转染前水平相当；均无P10和成熟ILIP蛋白表达。结论1HCMV感染THP1源性巨噬细胞后诱导AIM2炎性体组装，促进成熟IL1Β和IL18释放和细胞死亡；2AIM2蛋白是介导HCMV感染早期诱导巨噬细胞炎性体活化的必要感受器；3AIM2炎性体活化可在一定程度上抑制HCMV的早期和晚期基因转录；4在HCMV感染早期，病毒被膜蛋白PUL83可同细胞AIM2蛋白在胞质中结合；5PUL83结合AIM2蛋白可负向调节AIM2炎性体通路。

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